CTG-GCT-ACT-AAG-GAG-AGC-CGG-TGG-AGC (neoantigeno 1) — GCC-GCT-TAC (linker) — ATC-CTG-GAC-ACT-GCT-GGC-CGG-GAG-GAG (neoantígeno 2) ……………………………..
La secuencia muestra una cadena de ADN que consta de dos neoantígenos separados por un linker. Esta información se obtiene a partir de la secuenciación y el tratamiento informático asistido por IA del genoma procedente del tumor y de células sanas del paciente.
En esta etapa la vacuna terapéutica de Moderna es tan solo un archivo de texto con 34 neoantígenos separados por conectores (linkers) que indican a las proteasas celulares las posiciones por las que la proteína debe ser cortada.
El siguiente paso es convertir esta información en una cadena física de ADN. Para ello se utilizan máquinas automáticas que unen químicamente nucleótidos sintéticos uno a uno (mediante la química de fosforamidas) sobre soporte sólido.
Para tener suficiente cantidad de molde de ADN para producir el lote de la vacuna, ese primer fragmento sintético se amplifica masivamente mediante una PCR convencional generando millones de copias de la plantilla lineal. Otra técnica de amplificación muy utilizada consiste en insertar la secuencia en un plásmido circular, el cual se introduce en bacterias (E. coli) que actúan como «fotocopiadoras vivas» replicándolo millones de veces. Luego, el plásmido se purifica y se linealiza cortándolo con enzimas de restricción al final de la cola poli(A).
Con miles de millones de copias del ADN molde listas, se procede a la síntesis del ARNm. La enzima ARN, Polimerasa T7, lee el molde de ADN a partir de su promotor y transcribe la secuencia en una cadena de ARN mensajero complementaria. En la mezcla de reacción no se utiliza uridina común, sino análogos sintéticos (como la N^1-metilpseudouridina trifosfato), junto con ATP, GTP y CTP. La enzima incorpora estas bases modificadas a la cadena naciente de ARNm.
CUG-GCU-ACU-AAG-GAG-AGC-CGG-UGG-AGC (neo 1) — GCC-GCU-UAC (linker) — AUC-CUG-GAC-ACU-GCU-GGC-CGG-GAG-GAG (neo 2)……………………………
Durante o inmediatamente después de la reacción se añade la estructura Cap-1 en el extremo 5′ (mediante análogos de caperuza como CleanCap) para que el ribosoma del paciente reconozca el ARNm y lo traduzca eficientemente.
Terminada la transcripción se añade una enzima DNasa que digiere y destruye por completo el molde de ADN inicial, dejando únicamente el ARN intacto. El ARNm pasa por columnas de cromatografía para eliminar enzimas residuales, fragmentos incompletos y ARN de doble cadena no deseado, quedando listo para ser formulado en las nanopartículas lipídicas (LNP).
Una vez que el ARNm entra en el ribosoma celular se produce su traducción a una proteína, que en este ejemplo tendrá la siguiente estructura:
LATKESRWS (Neoantígeno 1) — AAY (Linker) — ILDTAGREE (Neoantígeno 2)…………………………………….
Las proteasas celulares cortan por el linker dejando libres los neoantígenos que serán preparados por la maquinaria celular para ser presentados con el complejo mayor de histocompatibilidad.
https://www.biontech.com/…/platforms/mrna-platforms.html